まとめ
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@teatimest SLIC のペーパーと似た方法でやってます。supple に秀逸な protocol がありますｗ -
@teatimest 私は最初の頃 30 でやっていましたが現在は 20 bp くらい
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@teatimest Overlap site を介して insert と vector がつながります。なのでそこのデザイン次第でどうにでもなります。制限酵素サイト入れたければ入れれるし、逆も
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@timasaki こんな感じでやれば、restriction siteつぶれますよね？出来上がったベクターからは。 http://yfrog.com/h2brip -
@teatimest 私の場合は primer の末端に homologou region がくるように設計して PCR でその領域をくっつけています。 末端にない場合はどうなのでしょう？うまくやってくれそうな気もしますが、やったことないです
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@teatimest 大腸菌の場合 recombination でやっているかは微妙です。一度 2本鎖DNA と一本鎖に treat した末端のもので反応を仕掛けたことがあるのですが、非常に効率が悪かったです。なので一本鎖同士をくっつけて、それを形質転換しているだけかも
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@timasaki @teatimest そうなると、末端のhomologyが低いと効率が落ちるか変なんができそうですね。 -
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@teatimest 正直やってみないと分からないです。とりあえず仕掛けてみて、その間に vector 領域を増やせる primer 発注するというのはどうでしょう？vector PCR で増やせば制限酵素サイトは削れます
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@teatimest @timasaki 下図で、切った制限酵素の次を変えれば潰れますよ。例えばgaatt-cのサイトでhomologyをgaattまでにして次をgにすればつながった後はgaatt-gになるという具合。どうでしょう？
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@teatimest pcr あとにDpnI でテンプレート処理するのお忘れなく。私はo/n でやってます @druoh
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@teatimest dpnIは大腸菌で増えたメチル化Dnaを切ってくれます。PCR産物はメチル化されない。
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それでテンプレートだけ消化してPCR産物のみにするのですね。うおさん、ありがとう。 RT @druoh: @teatimest dpnIは大腸菌で増えたメチル化Dnaを切ってくれます。PCR産物はメチル化されない。
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@teatimest むつかしいっすw
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@teatimest ピンと来ないw
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