@timasaki 蛋白によってHisタグ精製後に見られる260~270nmの変な吸光ピークが核酸の持ち込みではと思っているのですが、アグッた経験はまだ無いです。濃縮・ゲルろ過で消えていくので放置しますが、His以外のタグ精製で回避できる事がありました。
2015-07-24 06:57:34@timasaki AdipoRの精製論文読むと、まさに持ち込みの核酸でタンパクがアグったって書いてありますよね。あれはイオン交換のflow-throughを回収することで解決したみたいでしたが。 @kichi_hrs
2015-07-24 07:00:27@emeKato @timasaki GPCRだったかの論文で、可溶化時からMg2+をバッファーに加えているのを見た事があるのですが、あれって核酸の持ち込みを抑える目的なのでしょうか?
2015-07-24 07:03:54@kichi_hrs Stevensのところですね。あそこは結構気にしているみたいです。Mg2+もそうだと思いますが、膜とる時の超遠心でもhigh saltとlow salt buf.で何度も超遠心していますが、あれも中の人によると核酸除く目的らしいです。@timasaki
2015-07-24 07:05:53@kichi_hrs @emeKato ありがとうございます。AdipoRの話をそういえば失念していました。Q FTとかは今回の場合使えないのですがhigh salt, low saltというのはやってみます。
2015-07-24 12:29:15@emeKato @kichi_hrs ところでMg, ATPはなんのためでしょう?シャペロンでなくhelicase活性に何らか作用させるため?
2015-07-24 12:29:48@timasaki ATPはシャペロン外すためと聞いていたのですが、他の効果もあるんすかね?@emeKato @kichi_hrs
2015-07-24 12:35:30@t2438 外すためには入れたことあります。バンド的に効果あったことも。それ以外はよく分からじ @emeKato @kichi_hrs
2015-07-24 12:37:58@timasaki @t2438 @emeKato @kichi_hrs 横から申し訳ないですが、シャペロン(核酸がついてる?)だと思うんですが>Mg, ATP ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8051054
2015-07-24 12:39:02@tsukahisa これ、原著があったんですね。シャペロンの話はヒトから聞いただけで、どこに由来するのかまったく知らなかったです。@timasaki @emeKato @kichi_hrs
2015-07-24 12:42:36@tsukahisa ありあり。余計なバンドが見えない場合でもシャペロンの可能性あり? @emeKato @t2438 @kichi_hrs
2015-07-24 12:42:46@t2438 @tsukahisa @kichi_hrs @emeKato sizing void画分にでてきて 260/280を見ると260が高いんですよね。目的以外の夾雑はほぼなし
2015-07-24 12:44:20@t2438 @tsukahisa Mgもシャペロンなんですね、、ありがとうございます。@timasaki @kichi_hrs
2015-07-24 12:46:38@timasaki @t2438 お役に立てたのなら幸いですw まあリンクひいた論文もコンタミシャペロンはウエスタンで見てるから、結局めざすpurityによるかも。シャペロンに核酸がついてる場合は、260/280は良くなる気がする。 @emeKato @kichi_hrs
2015-07-24 12:46:52@timasaki なんとなくボイドに出るやつは核酸とか巻き込んでいるのか、260nmのほうが高くなりますよね。後々の精製に影響与えない場合は放置で良いのでは?@tsukahisa @kichi_hrs @emeKato
2015-07-24 12:48:47@timasaki あ、目的タンパクもボイっちゃうということですね、勘違いしてました。@tsukahisa @kichi_hrs @emeKato
2015-07-24 12:49:57@t2438 ほぼvoidにモノがいった場合は望みなしですかね。。共発現させて複合体とれてるからなんか望みありそうな気もするので捨てきれないところが悩ましい @tsukahisa @emeKato @t2438 @kichi_hrs
2015-07-24 12:50:20タンパク質精製中の除核酸処理について、これまで、ポリエチレンイミンの添加は既出ですか?
2015-07-24 15:55:49