参考文献 (簡易)
SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method
http://nar.oxfordjournals.org/content/40/8/e55
A simple and efficient seamless DNA cloning method using SLiCE from Escherichia coli laboratory strains and its application to SLiP site-directed mutagenesis
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/47
日本語でおk
cc.kyoto-su.ac.jp/~motohas/motoh… 京産大の本橋先生のSLiCE (Seamless Ligation Cloning Extract) from Escherichia coli laboratory strains やってみるかな
2015-09-05 06:09:32実際どうなのよ
.@r_tadacchi @takanzai SLiCE法によるクローニング結果でーす。Sequencingはしてないが、specific primersでコロピーしたので多分大丈夫:) flic.kr/p/yo2URy
2015-09-09 14:35:02CelLytic B Cell Lysis Reagent (Sigma, B7435) は買わなくても良かったか。。。まぁ効率がよりよくなるかもしれないからな。
2015-09-09 14:41:07vectorの濃度は30ng/ulだったので 1ul使って、インサート側は濃度測定してないが 3ul入れた。#面倒くさがり >SLiCE
2015-09-09 20:28:162種類のプライマーによるインサート確認(SLiCE後のコロピー) flic.kr/p/yqgvu2 明日はシークエンシング用プライマーが届くので最終確認。
2015-09-09 21:19:04今日は、Sigmaの試薬が到着したのでSLiCE反応液をつくってみるかな。違いもみたいし。取説を見るとmix for 5-10 minとなっているのだが。。。ローテーターで回してみるかな。
2015-09-10 18:07:30シークエンシングの結果、ちゃんと自分の目的遺伝子がSLiCEで挿入されているのを確認。何度かやってみて感覚もつかんでみよう。
2015-09-10 18:01:05旧来の方法でうまくコンストラクションできなかったので、今回はタイミング良くSLiCEが流れてきて試して成功したのでよかったかな。SLIC/In-Fusionでやればいいってのもあったのだが。
2015-09-10 18:12:03@emeKato 1/4~1/3のスケールでやってるんで、数百円ってとこですね。SLiCEはほんと簡単だったんで、すぐ試した方がいいですよ。K研ならケタ違いの数こなしてると思うんで・・・
2015-09-11 12:16:36@FumihiroKawai 私は失敗しましたが先輩が成功したようです(ODが増え切手にいないlysateで試しにやったのが原因です)
2015-09-11 12:22:39@shihoya1 僕も失敗したんよ一回目。。恐らく同じ原因と反応時間を長く取りすぎたダブルで。。。 TLみても成功例が出てきてるので安心しました(^^)
2015-09-11 12:26:04複数のPCR産物をSLiCE等でベクターに入れる時、効率が悪くなかなか入らない場合は、Overlap Extension PCRで一つの断片にしてしまってから入れるのが手軽でおすすめ。15bp程度の相同配列をつけて設計したプライマーだったら、OE-PCRで大抵つなげられるはず。
2015-09-13 12:21:17@kaoru_p これはキメラタンパク作るときだけでなく、制限酵素サイト潰したり、複数の変異を入れるのもわずか10サイクル程度のPCR反応で実現できるので応用性が高くて好き。特にcys_ala変異複数入れるときは一つずつ入れるよりはこの方法で変異まとめて導入した断片作る方が早い。
2015-09-14 18:55:26@ayanosatoh @r_tadacchi @druoh 一部相同配列が20bpじゃなかった... ベクター + PCRプロダクトを混ぜてトラフォメ。 スペシフィックプライマーでコロピー flic.kr/p/yB2jv4
2015-09-14 11:42:00