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Yuki
@yukidepon
（PMF注意１）泳動するゲル版は手袋して洗剤でよく洗う（手袋ごとスポンジで洗えばよい）。組み立ても新しいキムタオルの上で。泳動するときも手袋をする。間違っても素の指をバッファーに突っ込んではいけない。ケラチンカーニバルを喰らうことになるので。
2011-10-05 15:54:21
Yuki
@yukidepon
( ﾟдﾟ) 。o0（手袋はポッケに突っ込んでおいて直前にはめてから器具洗いようの洗剤＆スポンジで洗えばなんどでも再利用できるダニ。最後にRO水で手（袋）をすすぐことを忘れずにー）
2011-10-05 15:56:36
Yuki
@yukidepon
(PMF注意２）使用する水はRO水で問題無い。実験室で染色作業をしてもゲルを切り出す直前にゲルをRO水（１Lほどビーカーにくんでおく）で洗えば表面に付いたゴミは無視出来る程度になる
2011-10-05 16:00:18
Yuki
@yukidepon
（PMF注意４）泳動後のゲルは手袋をはめて洗い直した容器に入れる。後は銀染だけど使う器具は全て綺麗に洗うこと。シェーカーはウエスタン等ポリマーを使うものとの同時使用は絶対避ける。ポリマーはケラチンよりタチが悪い（シェーカーの上にも新しいキムタオルを敷いておくとよい）
2011-10-05 16:05:58
Yuki
@yukidepon
ﾀﾞﾒｪ(乂'ω') バンドが薄すぎる！往々にして銀染で焼き込んだ画像が送られてくるのだが、PMFに持って行くときは焼き込みNGで。これ以上時間をかけるとﾔｳﾞｧｲ!というさじ加減は自分でやってみないとわからない。ま、スケールアップをお願いするか～（一応PMFは最後までやる）
2011-10-05 16:41:41
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】昨日のゲル染色で言い忘れたポイントが一つ。市販のゲルは使わない方が良い。特にグラジエントゲル。ケラチン環境下で作成しているのでゲルに混入しているのでゲルベースのPMFには使わない方がよい。
2011-10-06 14:07:42
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】CBBで染まるようなアホほどあるバンドに関しては多少ケラチンが混入していてもケラチンごと同定できるから問題ないのだが、銀染でやっと染まるような極微量の場合ケラチン混入済みグラジエントゲルは致命傷となる
2011-10-06 14:09:26
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】切り出すバンドは微量であればある程シングルバンドを目指して精製しておく。電気泳動もシングルバンドにする精製手段の一つなので、そういった意味では二次元電気泳動は理想的かと。
2011-10-06 14:12:44
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】ゲルからのバンド切り出し。ここから3時間は出来れば人気の無い部屋（或いは夜）でエアコンを切って（空気を動かさない）作業する。洗ったガラス板の上にゲルをのせてメスで切るだけ。髪の毛、フケが落ちないように帽子を被る、無駄に動かない等の注意は必要
2011-10-06 14:21:22
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】切り出したゲル小片はチューブに回収。アセトにトリル脱水→還元アルキル化（修飾はお好みで）→酵素消化の行程にうつるわけだけど、作業直前に手袋をはめてスポンジで手を洗うのはお約束。
2011-10-06 14:24:51
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】ごく希にチップ内からケラチン混入がある（気がしている）ので使用するチップは溶液を吸ったら一度目は廃棄してチップ内を洗う（ほぼおまじないレベル）のがコツ
2011-10-06 14:26:54
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】消化酵素はトリプシンが一番性能いいけど、酸性アミノ酸が隣にあると切れにくいことが多いのよね。これはLEP（リジルエンドペプチダーゼ）を同時に添加することでカバー。これでデータベースサーチする時に切れ残り０（多くても１）での同定が楽になる
2011-10-06 15:00:25
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】酵素消化は５５℃消化とか電子レンジ消化とかの時間短縮裏技があるけど３７℃O/Nがラクチンであると思う。ここまでくればペプチド断片になるので以降の操作でケラチンに気を遣わなくてもよい（素手ハンドリングOK）
2011-10-06 15:03:26
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】加える消化酵素の量は切り出したバンドの濃さによって増減できるようになると良い。大体酵素ストック（100ng/micro-l)の１０－１５０倍希釈溶液を作って消化する。自己消化耐性の酵素だけどそれでもある程度ピークは出る（続く）
2011-10-06 15:42:05
Yuki
@yukidepon
【PMFケラチンフリーへの道】この酵素由来のピークを使ってキャリブレーションを行うと精度良く同定できる。RMSエラーが大体２０－４０ppm位の範囲で同定可能。ただ入れた酵素量が多すぎると目的ピークがイオンサプレッションで見えなくなるのである程度の経験が必要かも。
2011-10-06 15:46:00
Yuki
@yukidepon
誰得【PMFケラチンフリーへの道】でした。明日はMALDIで測定。気が向いたら誰得【MALDIで良質スペクトルの出し方】でもつぶやいてみるかのー。ニーズが超少ないし、扱えるひとは皆知っている程度のコツではあるけど
2011-10-06 15:50:20