オミクロン変異体・オミクロン株・ο株 サンガー法によるシークエンシングで変異を同定する方法(2022.1.10作成)

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

ο株の本格的な流行が始まりましたがvariantの同定に苦戦している様子なので、私の所で行っているサンガー法によるシークエンシングで変異を同定する方法を紹介しておきます。S遺伝子のうち重要な変異がある領域約2kbを前半後半とnested PCRし、そのPCR産物をダイレクトシークエンシングして同定します pic.twitter.com/3WZU6ZW6KZ

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研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

コピーアンドペーストしやすいようにプライマーの配列を以下に書いておきます（前半:1030bp） Spike_mut1-F1,TCTCTTCTTAGTAAAGGTAGACTT Spike_mut1-R1,AAACTTCAYCAAAAGGGCACA Spike_mut1-F2,CAGAGTTGTTATTTCTAGTGATGT Spike_mut1-R2,CTAACAATAGATTCTGTTGGTTG

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（後半:1184bp） Spike_mut2-F1,CTCAGAAACAAAGTGTACGTTGA Spike_mut2-R1,GTAAGCAACTGAATTTTCTGCAC Spike_mut2-F2,CCTTCACTGTAGAAAAAGGAATC Spike_mut2-R2,AAGTGACATAGTGTAGGCAATGA

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

この方法はδ株のゲノム解析用に設計したので、同定できるのはSタンパクの699番目のアミノ酸までです。ο株の下流の変異（N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, L981F）は同定出来ません。必要であれば残りの領域のPCRを別途行ってください。今のところS遺伝子の約2kbを同定出来ればvariantはわかります。

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

RT-PCRには東洋紡のKOD FX neoを使ってone stepで1st PCRを行います。他のDNA polymeraseではThermo FisherのPlatinum Taqを試しましたが、少々感度が落ちました(データは示しません)。1kbp以上のやや長いPCRはKODの方が得意なようです。 pic.twitter.com/eqMGYKdFZn

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研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

必要なRNAのコピー数ですが、N領域で300コピー以上あれば概ね前半後半ともに増幅することを確認しています。100コピー前後は出たり出なかったり、それ以下だと増幅は難しいです。（Ct値で言えば30以下がサンプルとして望ましい） pic.twitter.com/NpFONIzART

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研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

変異株の同定は今までは病態の進行を予想する程度の意味しかありませんでしたが、ο株では抗体カクテル療法の効果が著しく低下するため、治療を行う前にシークエンシングを行ってゲノム解析をする必要があります。逆にο株以外であれば、今までの抗体カクテル療法が行えるとの判断ができます。

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

東洋紡のKODを使う世界的に見るとちょっと特殊なPCRを行うので論文などにすることを見送っていました。単にPCRのプライマーを設計したというだけなのであまり論文化する価値がないので、この機会に紹介しました。プライマーはご自由に使っていただいて構いません。ゲノム解析の一助になればと思います

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追記：各プライマーの位置関係は添付画像のようになります。ο株にも対応しています。 pic.twitter.com/gFL3ev9MVT

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日付切取線 @krtr_date

✄------------ 1/11(火) -----------✄

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遂にウチにも「οかなぁ」という検体が届く（こんなツイートしてから1か月も経ってない twitter.com/uwemon/status/…

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Omicron国内で200人そう遠くないうちに手元に来るな pic.twitter.com/StgXwjtsBO

2021-12-23 21:12:02

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

明日はS領域のlong PCRをして明後日にシークエンシングって感じかな

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コピー数が少ないので成功するかどうか五分五分

日付切取線 @krtr_date

✄------------ 1/13(木) -----------✄

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δ株以降リアルタイムPCRがキッチリシグナルが出るようになったのはウイルス量が増えたという理由もあるけれど、検体採取方法が確立してみんな採取に慣れて上手になって失敗しなくなったというのもある感じがする（個人的感想です twitter.com/uwemon/status/…

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

たとえばN領域一カ所で1コピーくらいのシグナルしか出なかったら「コンタミかもしれないのでもう一回やらせて！」となって判定保留にする。残余検体を使ってもう一回PCRやるか改めて検体を取り直してもらうかする。δ株以降はウイルスのコピー数が多いのでこういう例は滅多に遭遇しなくなっているけど twitter.com/uwemon/status/…

2022-01-13 20:41:10

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

うわぁ…すごい数のNGS（NovaSeq6000）…まさに戦いは数だというイギリス ＞UK virus hunting labs seek to bolster global variant network | AP News apnews.com/article/genomi…

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NGS一台でヒーコラとゲノム解析をしている日本と大違いすぎる

日付切取線 @krtr_date

✄------------ 1/15(土) -----------✄

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一応この件についての報告。N領域でCq値36の2検体ウイルスのコピー数が少ないのでゲノム解析（シークエンシング）はちょっと厳しそうでしたが、Case1は一回目で前半部分1kbpだけ、Case2は泣きのもう一回で後半部分1.1kbpだけPCRがかかりました。Cq値36は10コピー程度、多分S領域の1コピーが増えてきた twitter.com/uwemon/status/… pic.twitter.com/5KkUPRnC2D

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Case1は前半部分だけですが、A67V, Δ69-70, T95I, G142D, Δ143-145, Δ211, L212I, ins214EPEが確認出来ましたのでomicron決定です。やっぱりdeletionが特徴的なので見た目で一発でわかります。 pic.twitter.com/xPlPDpKKcs

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Case2は後半部分だけ、G339D, A344V(new), S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K,D614G, H655Y, N679K, P681H, N764Kが確認されたのでomicron決定。報告にはない変異A344Vが見つかったのが気になるところ。日本特有のvariant？ pic.twitter.com/pJm1cmiDM6

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A344Vについては後でデータベースで確認が必要（サボってやってません）。Case2の人固有の変異かもしれない。

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

一応A344Vの証拠。GCCがGTCに変異してアラニンがバリンに置き換わる。変異の影響は不明。トランジションなので起こってもそれほど不思議ではない変異。 pic.twitter.com/M8eUL7rZyU

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研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

PCRの方法はこちら。N領域でCq値36という非常に低コピーのウイルスRNAの増幅という挑戦的な事をしましたが、半分成功と言ったところでした。Cq値36は10コピーくらい、経験上S領域のコピー数はNよりも少ないので本当に1コピーかそこらのRNAを増幅したのだと思います。 twitter.com/uwemon/status/…

研究者「」@1copyからのRT-PCR @uwemon

Alpha株以前の予備実験ではNで100コピー以上が必要で、その原因は完全長のゲノムを持っていないimmatureなウイルスが結構いるかヒト細胞内のサブゲノミックRNAを引っかけてきているせいだと思っていたのですが、ひょっとするとο株はほとんどがmatureなウイルス粒子なのかも？ twitter.com/uwemon/status/…