プラスミドゲート ～DNA混入問題～

molbio08 @molbio08

mRNA型生物製剤への製造時に使用した発現ベクターが、最終製品にかなりの量（ｍRNAの20％から35％）残存していることがある研究者から示され、アメリカでは最近問題に。plasmidgateというキーワードで検索すると関連する情報がたくさん見つかります。プラスミドゲート事件。大きな問題になるのか？ pic.twitter.com/zjJkPZRx33

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この図は発現ベクターの遺伝子マップ。赤い部分がスパイク遺伝子、oriと書かれた黄色い部分は大腸菌でDNAを複製させて増やすための複製開始点。赤で示されたのがスパイク遺伝子ですが、その上流部、矢印の起点付近にT7 promoter配列があります。この配列がｍRNA合成では重要なはたらきをします。 pic.twitter.com/lysbTKQ7EZ

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T7 promoter配列ですがT7というのは大腸菌に感染するウイルスの1種のこと。この配列があるとそこにT7由来のRNA合成酵素が結合して大量にｍRNAを合成することができます。さらに、このDNAにはSV40プロモーター配列も存在していますのでその下流の遺伝子はヒト細胞でも発現。薬剤耐性遺伝子も存在します

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NeoR遺伝子（オマイシンという抗生物質に耐性にするための遺伝子）が加えられています。この選択マーカーは大腸菌でも哺乳類細胞でも使用できますので、ファイザーの研究者たちは、この発現ベクターをヒト細胞に導入して実験することも考えていたのかもしれません。MluIとかStuIとかは制限酵素部位。

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MluIとかStuIとかいうのが円からはみ出して書かれていますが、これらは制限酵素のことで、細い線で示された部分がこれらの制限酵素（ある特異的な演繹配列を認識してそこで切断する酵素のこと）で切断される部位です制限酵素切断部位と呼びます。このプラスミドの全長は約7500塩基でかなり長い部類。

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mRNA型生物製剤に困窮しているとされていた量は、最初は3000分の1とか350分の1とかだったのですが、MITでヒトゲノムの解析プロジェクトに参加し、次世代型DNAシークエンサーのSOLidの開発にも参加した研究者のKevin McKernanさんが自分のブログで発信しました。それがきっかけで問題になりました。

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さあ大変だということで、こんなイラストが貼り付けられた発信もあります。アメリカでは追加接種を行う人はほとんどいませんし、追加接種者の割合も日本より遙かに少ないので、今更、なんだという雰囲気です。一方、日本ではDNA混じりのｍRNA型生物製剤をなんと、これからも接種しようとしています。 pic.twitter.com/LKPExPt3Fw

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政府は、ｍRNAの合成に使用した発現ベクターがｍRNAの20％から35％含まれたものを今から接種するのでしょうか。スパイク遺伝子をヒトゲノムに導入したらどうなるかという大規模な人体実験を行うようなものです。この図に書かれたような実験をヒトで行うことになります。これは正気の沙汰ではない。 pic.twitter.com/eXatW17zYM

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脂質ナノ粒子（LNP）にプラスミドDNA、それも直鎖状にされたものを内包させると高い効率で細胞にDNAが導入されます。この際の導入される細胞は非特異的でLNPが遭遇した細胞に片端から遺伝子が入ります。細胞内に導入された遺伝子は一部は細胞内で分解されますが、多くの分子は核に移行します。

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DNAを細胞に導入した場合、この確率は1％から1万分の1程度と言われています。この遺伝子の導入反応には逆転写酵素は不要です。そのため、ｍRNAだけのものと比べると格段に高い確率でゲノムに組み込まれます。 ここで明記しておきますが、この発見はまだ研究者一人のものでブログ記事です。

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さらに続けます。プラスミドというのは細菌の染色体外DNAです。遺伝子工学で使用される遺伝子を細胞に導入するときに使用するベクターの1種です。これには遺伝子の改変に主として使用するクローニングベクターと遺伝子発現を目的とした発現ベクターとがあります。今回のものは発現ベクターです。

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今回、問題になっているのは発現ベクターです。発現ベクターというのは発現したい、つまり、mRNAを合成したい遺伝子の上流部にプロモーター配列を持っていて細胞に導入するとｍRNAが大量に生産されます。あるいは試験管内でRNA合成酵素と基質を加えるとmRNAを合成することが可能です。

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ここで、mRNA型生物製剤に使用されているｍRNAがどのように製造されているかを説明。スパイク遺伝子はかなり長いため有機合成的な方法でのいわゆる化学合成は不可能。そのため、DNAからｍRNAを試験管内で酵素を使用して合成する方法を採用。RNA合成酵素を使用してDNAから合成するというものです。 pic.twitter.com/gA1WIj81Pi

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RNAを構成する基質、つまり、構成ブロックですが、ヌクレオチド三リン酸を4種類、A,C,U,Gを加えます。この中のU,ウリジンが、本来のウリジンではなく1メチルシュードウリジンを使用。T7RNA合成酵素は強力なRNA合成能力を持っており、この方法でシュードウリジン化されたmRNAの大量生産が可能です。

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反応が終了した時点では、RNAにDNAが混じっている状態ですので、この反応が完了した段階でDNAを除く必要があります。DNAを除く方法ですが、RNAには反応せずにDNAだけを分解する酵素を使用すればDNAを断片化して取り除くことは可能。今回はこの酵素処理が不十分だったと考えられています。

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既にmRNA型生物製剤にDNAが混じっているという報告があったことを契機にKevinさんが混じっている量を調べたのが今回紹介している記事です。どのような方法でDNAの量を策定したかを細かく説明されており。その方法は妥当なものだと思いました。結果の一例として定量的PCR法の結果をあげておきます。 pic.twitter.com/k2tjtWhXf2

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定量的PCR法、アガロースゲル電気泳動法などで解析しさらには次世代型DNAシークエンサーで塩基配列解析のも行っています。プラスミドは直鎖状にされていますが環状のものも残存していたということ。解析の結果、最終的に含まれるDNAの量はｍRNAの20％から35％というのが彼の結論です。

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ここで彼の元ツイッターを貼り付けておきます。Kevinさんですが、現在は受託分析のバイオテックのCSOで創業者。彼は関連する論文をたくさん発表しています。ここからブログ記事に行くことも可能です。twitter.com/Kevin_McKernan…

Kevin McKernan @Kevin_McKernan

There has been a lot of fruitful discussion over poly A tails in the vaccine vector. It warrants a Post Script which is now at the bottom of this substack. TL/DR. Wait for the RNase A libraries to sequence. 100 PolyAs are notorious for mis-assembly open.substack.com/pub/anandamide…

2023-03-11 11:58:41

molbio08 @molbio08

途中でも書いておきましたが、これは査読済みの論文の紹介ではありませんが、これが事実だった場合のインパクトはかなり大きいので紹介することにしました。彼は論文として発表することを考えていますが、問題は採択してくれるジャーナルがあるかどうかでしょう。

molbio08 @molbio08

この定量結果が正しいのか、ロットごとのばらつきはあるのか、など残された課題は多々ありますが、品質に問題のあることは否定できないでしょう。発現ベクターDNAがこれだけまじったものをヒトに接種するとかなりの確率でスパイク遺伝子がゲノムに取り込まれます。その影響は計り知れません。

molbio08 @molbio08

Kevinさんが行った実験はそれほど困難ではありません。分子生物学の研究室であれば容易に実験可能。残念ながらmRNAワクチンは研究者に供給されておらず実験不可能。厚労省の関係研究機関はこのことが事実かどうか実験して国民に示す責任があると思います。否定されるまでは接種を中止すべきです。

molbio08 @molbio08

このようなゲノムの改変につながる懸念が出てきた以上、接種を即座に中止すべきです。DNAが混じっている量にばらつきがあるとしても接種を繰り返すほどリスクは高まります。非接種者はもう接種しないでしょう、接種された方も追加接種は絶対にやめましょう。ここで立ち止まることが重要です。

ぷちトトロ @petite_totoro

@molbio08 いつも拝見しています。 すみません、理解はほぼできなかったのですが、6つめのツイートの「困窮している」は「混入している」でしょうか？ 最初の方の内容は理解できてませんが最後まで読んでみて、プラスミドがワクチンに混ざってる（残ってる）という話なんだなと理解したのですが。。