プラスミドゲート ～DNA混入問題～

molbio08 @molbio08

@petite_totoro 指摘ありがとうございます。混入の間違いでした。

molbio08 @molbio08

その通りです。実は転写反応の前には環状プラスミドDNAを制限酵素で切断して直鎖状のDNAにする過程も含まれていますが、それも十分確認していないようです。それで環状DNAが残存し、さらにDNaseIの処理が不十分だ立ったためDNAが残ってしまったのではとKevinさんは考えています。初歩的ミスです。 twitter.com/7xCzVz2knym9PS…

毒母乳 @7xCzVz2knym9PSL

@molbio08 これの２番目の工程でしょうか？ やっぱり焦って大量生産した新製品にはロクなもんがないなぁ・・・ これが本当なら、後工程の品質もあやしいものです🥺 twitter.com/mt9jyo/status/…

2023-03-13 10:14:41

molbio08 @molbio08

補足です。この補足は上級者用です。説明が不十分ですので、理解できなくても気にしないでください。 pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10979193/… twitter.com/i/web/status/1…

J Sato @j_sato

@molbio08 ・1回の接種に含まれるLNPの数は、ファイザー100億個、モデルナ400億個 ・そのうち20~35%にプラスミド直鎖状DNAが含まれる ・細胞に入ったDNAのうち0.01~1%が核に移行する という3つの情報から、1回接種すると、細胞の数に幅はあっても、ほぼ全員スパイク蛋白製造人間になるということでしょうか？

molbio08 @molbio08

@j_sato コメントありがとうございます。実際の状況としてはmRNAの分子数がファイザーで13兆個ですので、一個の脂質ナノ粒子に1300分子のmRNAが含まれることになります。1300分子のうち20〜35％がDNAですので、ざっと300分子くらいの直鎖状プラスミドベクターが1個のナノ粒子に含まれることになります。… twitter.com/i/web/status/1…

molbio08 @molbio08

Plasmidgateについてですが、今朝、早朝の4時からKevinさん登場のRumbleライブが開催されました。セネフさんのプレゼンから始まり、最後はKevinさんのプレゼンで終わるというものでした。KevinさんはmRNA型生物製剤へのDNAの大量残存をどのような経緯で見つけたかを説明していました。リンクは次に。

molbio08 @molbio08

セネフさんのプレゼンはプリオンに関するものでした。これもスライドを使用して説明していて参考になりました。今回はこのRumble動画で聞いたことを中心に発信します。Kevinさんは誠実な研究者という印象でした。 rumble.com/v2dgaf6-scienc…

molbio08 @molbio08

KevinさんはmRNA型生物製剤へのDNAの大量残存をどのような経緯で見つけたかを説明していました。mRNA型生物製剤に、転写が途中で完了した短いRNAが含まれているかもしれないと考えてRNAを逆転写してDNAに変換して配列決定をしてみたら予想していなかったベクター配列が見つかったというのが出発点。

molbio08 @molbio08

その後、DNAの定量、塩基配列の決定などを行った結果、大量のDNAの夾雑を見つけたという流れです。環状のプラスミドDNAも残存していて大腸菌を形質転換できてコロニーができるくらいですから、スパイクタンパク質の全長とT7プロモーターが連結されたものが残存している可能性は否定できない。

molbio08 @molbio08

Kevinさんは発現ベクターの配列を既に公開しており、さらにKevinさんが検証用に設計したPCRプライマーの配列も公開ずみ。後に続く研究者は出てくるでしょう。今回、Kevinさんが調べたロットだけなのか、あるいは多くのロットに同様に発現ベクターが含まれているかはいずれ、明らかになるでしょう。

molbio08 @molbio08

私が当初からmRNAワクチンのリスクを説明し警告したにもかかわらず、残念ながら接種してしまった人間が、私の周辺にも少なからずいます。そのため、今回のDNAの夾雑は特定のロットに限られていると言う結論を私は期待しています。どのような結論になるか他の研究者の追加の情報を待ちたいと思います。

molbio08 @molbio08

T7プロモーターは哺乳類細胞では機能しないと思いがちですが、もう一つ論文を紹介しておきます。ここで紹介する論文では、T7プロモーターがヒト細胞で機能することを示しています。T7プロモーターがHeLa細胞で機能するというもの。HeLa細胞はヒト子宮がん由来の有名な細胞。 pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8406019/

molbio08 @molbio08

スパイク遺伝子がT7プロモーターと連結された形態でヒトゲノムに組み込まれたときにスパイク遺伝子が発現する可能性は考えておくべきでしょう。スパイクのｍRNAは環状プラスミドを制限酵素で一カ所切断して、それを使用してT7RNA合成酵素でｍRNAを大量に合成しています。

molbio08 @molbio08

通常であれば、この方法では、1分子のDNAから10倍～100倍のｍRNAを合成できるとされていますので、このように大量に夾雑していることは考えにくいのですが、ウリジンが修飾されたシュードウリジンであるためにRNA合成の効率がかなり低下している可能性も考えられますのでこの点も検証が必要です。

molbio08 @molbio08

ｔRNAにはシュードウリジンが含まれていますのでｔRNAを合成するRNA合成酵素はシュードウリジンを効率よく利用できるはずですが、mRNAにはシュードウリジンは通常含まれません。したがってｍRNAを合成するタイプのRNA合成酵素がシュードウリジンをウリジンと同様に利用できるかは不明です。

molbio08 @molbio08

混じっている発現ベクターが環状のものかあるいは切断されたものかをKevinさんは解析していますが、環状のものも切断されたものも両方含まれている。環状のものだけであれば、残存したとしてもゲノムに組み込まれる際にはランダムな場所で切断されてからゲノムに組み込まれることになります。

molbio08 @molbio08

この場合にはゲノムに組み込まれてもスパイクタンパク質を発現する可能性は低いでしょう。しかし、実際には、T7プロモーターの上流部で切断していますので、もしもゲノムに取り込まれるとするとT7プロモーターとスパイク遺伝子が連続した形でゲノムに組み込まれる可能性は高いと思います。

molbio08 @molbio08

発現ベクターの夾雑が招くリスクはもう一つあります。SV40プロモーターがこの発現ベクターには組み込まれていますので、この配列を含むDNA断片が発がん遺伝子の上流部に組み込まれると発がん遺伝子の発現が亢進します。このことは細胞のがん化のリスクを高めることは言うまでもありません。

molbio08 @molbio08

DNA型腫瘍ウイルスであるSV40の強力なプロモーターのゲノムへの組み込みのリスクはKevinさんも言及。このようにベクターDNAが混じっているようではエンドトキシンの混入も懸念されます。これも彼は動画でコメントしています。エンドトキシンは細菌由来の毒素でアナフィラキシーなどの原因になります。

molbio08 @molbio08

何度も書いているように発現ベクターがmRNA型生物製剤に大量に残存しているということを発表しているのは現時点ではKevinさん一人です。またKevinさんはロットを多数調べたわけでもありません。しかしながら、ファイザーとモデルナ両方で同様に観察されたということを私は大変重く見ています。

molbio08 @molbio08

Kevinさんは発現ベクターの配列データを既に公表済みであり、PCRのプライマーも発表していますので他の研究者にも追試は可能になりました。KevinさんはLNPを除去しないといろいろな反応が動かない可能性についてもコメントしていましたので、実験する人は注意が必要です。DNAを精製後解析すべきです。

molbio08 @molbio08

ゲノムへの組み込みがどのような細胞でおきるかについても議論されていました。DNA断片がゲノムに組み込まれる場所はランダムです。また培養細胞にプラスミドを導入する実験を行うと一定の確率でゲノムに入ります。組み込まれる機構も相同組み換えだけではないことを考える必要があります。

molbio08 @molbio08

増殖している細胞であればゲノムに組み込まれる可能性がありますが動画で彼がコメントしていたのは生殖系列の細胞と免疫系の細胞です。特に免疫系の細胞においてはゲノムの再構築が頻繁に行われますので、リンパ節にLNPが移行してDNA断片の組み込みがおきる可能性が高いのではと私も思いました。