構造解析にむけた膜タンパク質発現について雑談

ima3 @timasaki

@hshigema なるほど。でも私のターゲットは核の中に。。

shige @hshigema

マッキノンラボの方はE. coli-Yeast-Insect Cellと系を変えていくそうです。YeastでうまくいかなくてInsect Cellで10倍程度取れればそっちを使うとのこと。ただしマッキノンのラボでは細胞外ドメインくらいしかそういう例はないそうです。

shige @hshigema

というわけで、細胞膜貫通型のイオンチャンネルの場合、昆虫細胞では最大で酵母の10倍量の発現が期待できると考えているようです。でも、昆虫で発現するとリーキーで細胞毒が問題になることが多いとのこと。どうも酵母では開状態にする因子が足りないのが幸いなのかも、とのことです。

shige @hshigema

@HattoriM @timasaki これはその通りですね。なのでうちのラボでも使ってますが、結構、根源的な問題点にぶち当ってます。あと一ヶ月くらいでわかりそうですが...私が自分でやればすぐわかるんですけど、学生さんのプロジェクトなので...

shige @hshigema

@HattoriM @timasaki 最近はGFP融合型などを使ってゲル濾過で界面活性剤screeningをかねてチェックするのが一般的かと。リガンド結合型は結合実験でいいですが、それ以外のイオンチャネルなどはリポソームに埋め込んでアッセイですかね？あとは熱かけてゲル濾過とか？

shige @hshigema

Eric Gouauxラボの場合、HEKでコンストラクトの確認をして、いけそうなら昆虫細胞で発現。ある程度取れればそれでGo!なのではないか、と。どうですかね@HattoriM？ここで気になるのはリーキーで細胞毒が高い発現系がどのくらいの頻度で出てくるのか？ですね。