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uchida_kawasaki
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ramos
@ramos59454108
PCRの感度特異度デマはだいぶ減って来たと思うけど、もしかすると検査推進側にもまだ誤解があるのではと思うのでまとめる。 ①ギリギリ陽性←✕ ②全自動検査機←不要 ③迅速診断試薬の注意点
2020-07-23 11:12:43
ramos
@ramos59454108
①ギリギリ陽性は間違え 何度か述べて来たけど、qPCRは定量技術だが、MIQEにもある通りウイルス診断分野では定量ではない。 ふつーの検査→検量線引いて測定。値を求めて定量 qPCR→検量線引いて測定。値を求めて、で？ 出てきた値は例えばコロナ遺伝子1000個
2020-07-23 11:16:45
ramos
@ramos59454108
だから何？って突っ込まれる。何故かというと遺伝子抽出効率はサンプルによって劇的に違うからだ。入ってた細胞数も違う。 遺伝子という繊細なものを測定しようとしていることを理解して欲しい。 だから測定前に凄く厳密にtotalRNA濃度を揃える。それでも定量とは言えない。
2020-07-23 11:20:23
ramos
@ramos59454108
例えばある人の唾液1mlにウイルスが100個いて、自然脱落表皮細胞が1個いる。 次の人の唾液1mlにウイルス100個いて、自然脱落表皮細胞が1000個いた場合 二人のRNA濃度を揃えると、Aさんの検体はほぼウイルスだが、Bさんの検体はほぼヒト細胞だ。ウイルス出してる量同じなのに。 これをPCRする。
2020-07-23 11:24:41
ramos
@ramos59454108
Bさんをギリギリ陽性だから弱感染者！とか言ってしまったら誤診もいいところだろう。 いやウイルス出してる量同じやんけ。 じゃあどうする？ 唾液1mlあたり人工遺伝子Tを1000個入れてみて。そしてRNA濃度を揃えqPCRする。 そしてコロナ遺伝子と遺伝子T両方を測定し、コロナ÷Tをする。
2020-07-23 11:30:25
ramos
@ramos59454108
そうすると唾液1μlあたりのコロナ遺伝子数が算出できる。 ここまでやって初めて定量になる。 それもあくまで唾液1μlあたりの。という若干曖昧な条件付き。 スワブなら？ 粘膜上層の粘液上にいるウイルスと粘液上皮細胞に感染しているウイルスがいるだろう。 前者を無視するなら今度は唾液と逆だ。
2020-07-23 11:35:58
ramos
@ramos59454108
細胞の1個しか取れていないAさんサンプルと細胞の1000個取れたBさんサンプルがあり、同じ量のVTMに希釈されている。 実は細胞一個あたり100コロナ遺伝子相当二人とも感染している。 検量線引いてコロナ遺伝子数測っただけではAさんはギリギリ陽性。だからといって弱感染者と思わないで。同じだっての
2020-07-23 11:39:40
ramos
@ramos59454108
だから今度はヒト細胞数あたりで割り算しないと、本当の感染量を反映しない。 ActbでもRPLでもいいから補正しなさい。(Gapdhは使うなとあれほど…) なお、割り算用の遺伝子がそもそも個人差デカかったら無意味になる。 さて、どんな測定にも若干の誤差は出る。 そうすると実は割り算する遺伝子は
2020-07-23 11:43:17
ramos
@ramos59454108
適当には選べない。 例えば個人差少なくて、サーカディアンリズム等によらず安定発現で、でも凄く存在量が少ない遺伝子を割り算遺伝子に選んでしまうと 測定したい遺伝子:割り算用遺伝子＝10万:10とかになる。 1万の±5は誤差だが10の±5は？それで割るの？ だから普通は測定遺伝子量に近い
2020-07-23 11:46:47
ramos
@ramos59454108
遺伝子を割り算用(リファレンス遺伝子と言います)に選べ。と昔の教科書には書いてあったが最近見ないな。これはまぁちょっと脱線か。 逆もしかり。 さて、ギリギリ陽性って言ってる人達がこの部分を理解してるとは到底思えない。
2020-07-23 11:49:01
ramos
@ramos59454108
ちゃんとやるなら測定してその条件での遺伝子数を見たあとに、定量のための割り算遺伝子選ばなきゃいけないもん。2度測ることになるもん。 そんなんやるか？ ①ギリギリ陽性←お前がよほど変態暇人でない限り何か勘違いしてるぞ でFA
2020-07-23 11:52:45
ramos
@ramos59454108
因みにウイルス診断分野において必要なのは感染者か否かをきちんと診断することです。定量とかいらんわ なのでProbe法を使いPCRサイクル50回転を確保した上で、生理食塩水にコロナ遺伝子5, 50, 500, 5000, 50000個それぞれ溶かした液作って同条件で抽出測定し、検査限界把握し、閾値にすること。
2020-07-23 11:58:37
ramos
@ramos59454108
そうすれば、ギリギリ陽性なんかないことがわかります。 むしろギリギリ陰性だけどコイツ陽性者じゃね？ってことはあり得る 例えば5コピーのコロナ遺伝子Cqが35で、ネガコンは地平線で、検体のCq35.5だったら？ ルール上陰性だけど、俺なら再試験するわ。 だって5から始めたラボが悪いもん
2020-07-23 12:02:45
ramos
@ramos59454108
抽出効率がなんかの原因で悪かっただけのサンプルの可能性高いもん。 そのうち、ギリギリ陰性問題出てきて、だからCDCは陰性でも信用するな再検査しろってガイドラインに書きまくってるだろ。以前言っただろってTweetすることになると思ってたけど ギリギリ陽性って言葉が広まってるのは草
2020-07-23 12:05:31
ramos
@ramos59454108
②全自動検査機←不要 PCRは原理は少し難しいかもしれませんが、やることは簡単です。 1、試薬を混ぜて下さい 2、プレートの穴に検体入れて下さい 3、プレートの穴に混ぜた試薬入れて下さい 4、プレートにシールしてスイッチ押して下さい 質問、これリバァイにしかできませんか？
2020-07-23 12:09:20
ramos
@ramos59454108
マジでPCRはやることこれだけです。 僕が前から1日300件俺でもできるだの、なんでやらない？だの、誰でもできるだの、言ってる理由はこれです。 もう一度言います。 「混ぜてスイッチ押すだけ」できないの？ たぶんふわとろオムレツ作る方が1億倍難しいです。だって俺実際まだ作れねぇもん
2020-07-23 12:11:53
ramos
@ramos59454108
さて、じゃあ何が大変かって言うと、RNA抽出精製がくそ大変です。 もっと言うと精製が試薬入れる回数多くて面倒なだけです。 ちなみにqiagenとかのマニュアルは2時間でできるよ！とか短い時間書いてますが、嘘です オプション項目にある「うまく行かない場合この操作加えてね」を始めから全部加えて
2020-07-23 12:14:55
ramos
@ramos59454108
下さい。でないとまず初心者にはqPCRに耐えれる綺麗なRNAを取れません。 なので、宣伝文句(標準プロトコル)をそのままコピペしただけの感染研マニュアルもダメです。 そしてこれらの話はすべて無意味です。 ウイルス診断分野、定量しねぇもん。いるかいないか分かればいいもん。 ＝抽出精製いらない
2020-07-23 12:17:52
ramos
@ramos59454108
そこで迅速診断試薬を使えとずっと言っています。 島津や東洋紡のＨＰで迅速診断試薬の手順を見ましょう。 混ぜるだけです。抽出は試薬が勝手にやってくれるし、もう定量しないから精製→RNA濃度合わせしないスタイルです。 だってやりたいの診断でしょ？ さてここで全自動検査機に戻ります
2020-07-23 12:21:42
ramos
@ramos59454108
全自動検査機とは、聞こえはかっこいいのですが、何をするかと言うと RNA抽出精製の 「試薬入れて遠心してまた試薬入れてまた遠心してまたまた試薬入れて…」 をロボットアームが勝手にやってくれます。 最後のPCR試薬混ぜて入れて入れてスイッチオンもロボットがやってくれます。
2020-07-23 12:24:21
ramos
@ramos59454108
一言で言うとロボットの無駄使いです。 まず、定量においてもっとも大事な「RNA濃度を厳密に揃える」これをやってません。研究者としてこれほど定量に使えないものはありません。 (研究分野ではRNA抽出精製の全自動機械は使われます。濃度揃えとPCRスイッチ押すは自分でやるスタイル)
2020-07-23 12:26:59
ramos
@ramos59454108
じゃあ、診断分野では？ いや、素直に迅速診断試薬使えよ。 精製してる時点でロボットの無駄使いですよね。 個人的にはアメリカ軍が不要になった雑魚戦闘機や空母を日本が高値で買い取ってあげる程度の 慈善事業以外、全自動検査機のメリットを見出せません。 だって「混ぜるだけ」でいいのに
2020-07-23 12:29:28
ramos
@ramos59454108
わざわざ精製という無駄な操作をやり、かつその成果を(正確に濃度揃えないから)ドブに捨てるシステム 億円払って買います？ いや、そこはお前の手で混ぜろよ。 としか思わないわけです。
2020-07-23 12:30:53
ramos
@ramos59454108
②全自動検査機←慈善事業目的なら金払えば？ となります。 ③迅速診断試薬の注意点 僕は迅速診断試薬推しですが、問題点をあげて置きます。 RNAを抽出し、精製します。この操作は定量しないんだから新コロPCRには不要です。と言って来ました。 それは事実ですが、原理を少し見ましょう
2020-07-23 12:34:03
ramos
@ramos59454108
細胞からどうやって核酸を抽出するの？ すげぇ蛋白溶かす化学試薬で細胞膜溶かし、あらゆる蛋白を変性させ、遺伝子を浮かすだけです。 よくRNAは不安定！という人がいますが極論すればデマです。生命が不安定な物を自分の設計図にするわけないでしょう？ RNAは物理化学的に安定。だから「感染」する
2020-07-23 12:36:48