編集可能
2011年7月28日

制限酵素サイトの跡形がのこらないクローニング

クローニングした時に制限酵素サイト、またその名残が入っちゃ嫌な時、どうしたらいいのかいろいろ助言をいただきましたので、まとめときます。
21
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki いまさん、自作in-fusionしてるのですか?

2011-07-28 11:46:27
ima3 @timasaki

@teatimest SLIC のペーパーと似た方法でやってます。supple に秀逸な protocol がありますw

2011-07-28 11:47:15
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki キットのプロトコルでは15ntオーバーラッブなのに、ペーパーは30だったか40ntがoptimal って書いてあったので、どうしてるのかなと。

2011-07-28 11:51:03
ima3 @timasaki

@teatimest 私は最初の頃 30 でやっていましたが現在は 20 bp くらい

2011-07-28 11:51:52
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki おおおお!じゃ24ntFLAGアダプタ付けた、酵母用プライマーつかいまわしできますね。やった。

2011-07-28 11:57:54
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki あともういっこききます。overlapのアダプター、制限酵素抜ntきでやったら、出来るベクター制限酵素サイト潰れますか?

2011-07-28 12:26:16
ima3 @timasaki

@teatimest Overlap site を介して insert と vector がつながります。なのでそこのデザイン次第でどうにでもなります。制限酵素サイト入れたければ入れれるし、逆も

2011-07-28 12:28:40
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki こんな感じでやれば、restriction siteつぶれますよね?出来上がったベクターからは。 http://yfrog.com/h2brip

2011-07-28 12:42:17
ima3 @timasaki

@teatimest 私の場合は primer の末端に homologou region がくるように設計して PCR でその領域をくっつけています。 末端にない場合はどうなのでしょう?うまくやってくれそうな気もしますが、やったことないです

2011-07-28 12:47:00
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki 酵母の場合、restriction site があっても、homonogous recombination regionが200ntあっても、文句言わずにやってくれたのですが、どうしても酵母が嫌いなクローンがあるので、

2011-07-28 12:50:37
ima3 @timasaki

@teatimest 大腸菌の場合 recombination でやっているかは微妙です。一度 2本鎖DNA と一本鎖に treat した末端のもので反応を仕掛けたことがあるのですが、非常に効率が悪かったです。なので一本鎖同士をくっつけて、それを形質転換しているだけかも

2011-07-28 12:53:15
UO @druoh

@timasaki @teatimest そうなると、末端のhomologyが低いと効率が落ちるか変なんができそうですね。

2011-07-28 13:03:18
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@druoh @timasaki もうちょっと補強した版ですが、これで制限酵素サイトが殺せたらなと思ったわけです。 http://yfrog.com/ke5jhp

2011-07-28 13:10:43
ima3 @timasaki

@teatimest 正直やってみないと分からないです。とりあえず仕掛けてみて、その間に vector 領域を増やせる primer 発注するというのはどうでしょう?vector PCR で増やせば制限酵素サイトは削れます

2011-07-28 13:13:33
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@druoh @timasaki ベクターをPCRするのですね。その手があったのですね。ありがとうございます。

2011-07-28 13:19:49
UO @druoh

@teatimest @timasaki 下図で、切った制限酵素の次を変えれば潰れますよ。例えばgaatt-cのサイトでhomologyをgaattまでにして次をgにすればつながった後はgaatt-gになるという具合。どうでしょう?

2011-07-28 13:21:21
ima3 @timasaki

@teatimest pcr あとにDpnI でテンプレート処理するのお忘れなく。私はo/n でやってます @druoh

2011-07-28 13:21:33
UO @druoh

@teatimest dpnIは大腸菌で増えたメチル化Dnaを切ってくれます。PCR産物はメチル化されない。

2011-07-28 20:46:00
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

それでテンプレートだけ消化してPCR産物のみにするのですね。うおさん、ありがとう。 RT @druoh: @teatimest dpnIは大腸菌で増えたメチル化Dnaを切ってくれます。PCR産物はメチル化されない。

2011-07-28 22:41:14
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

@timasaki @druoh 実は、もっとややこしい解決方法で手を打っている最中なのです。ベクターをもうちょっと上流と下流で切って、制限酵素配列なしプライマーでその切られた5'&3'の1kbをPCRで増幅、そして、5’&3’フラグメントと目的の遺伝子のPCRプロダクト、三本を

2011-07-28 13:21:38
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

えー、ちょっとまって。お絵かきるから。@timasaki @druoh

2011-07-28 13:27:03
TheOrbitalTeapot @tea_gondii

ごめんなさい、提出おそくなりました。先生、これでどうでしょうか?in-fusionいけるでしょうか? @druoh @timasaki http://yfrog.com/h05p3lp

2011-07-28 13:52:23
残りを読む(35)

コメント

TheOrbitalTeapot @tea_gondii 2011年7月28日
いまさんのツイート拾えない。
0
TheOrbitalTeapot @tea_gondii 2011年7月28日
いまさんのツイート補完完了です。
0
ima3 @timasaki 2011年7月28日
@timasaki の発現をオリジナルなものと入れ替えました
0
TheOrbitalTeapot @tea_gondii 2011年11月17日
SLIC (Site- and Ligation-Independent Cloning)のトラブルシューティングを追加しました。
0