制限酵素サイトの跡形がのこらないクローニング

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki いまさん、自作in-fusionしてるのですか？

ima3 @timasaki

@teatimest SLIC のペーパーと似た方法でやってます。supple に秀逸な protocol がありますｗ

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki キットのプロトコルでは15ntオーバーラッブなのに、ペーパーは30だったか40ntがoptimal って書いてあったので、どうしてるのかなと。

ima3 @timasaki

@teatimest 私は最初の頃 30 でやっていましたが現在は 20 bp くらい

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki おおおお！じゃ24ntFLAGアダプタ付けた、酵母用プライマーつかいまわしできますね。やった。

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki あともういっこききます。overlapのアダプター、制限酵素抜ntきでやったら、出来るベクター制限酵素サイト潰れますか？

ima3 @timasaki

@teatimest Overlap site を介して insert と vector がつながります。なのでそこのデザイン次第でどうにでもなります。制限酵素サイト入れたければ入れれるし、逆も

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki こんな感じでやれば、restriction siteつぶれますよね？出来上がったベクターからは。 http://yfrog.com/h2brip

ima3 @timasaki

@teatimest 私の場合は primer の末端に homologou region がくるように設計して PCR でその領域をくっつけています。 末端にない場合はどうなのでしょう？うまくやってくれそうな気もしますが、やったことないです

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki 酵母の場合、restriction site があっても、homonogous recombination regionが200ntあっても、文句言わずにやってくれたのですが、どうしても酵母が嫌いなクローンがあるので、

ima3 @timasaki

@teatimest 大腸菌の場合 recombination でやっているかは微妙です。一度 2本鎖DNA と一本鎖に treat した末端のもので反応を仕掛けたことがあるのですが、非常に効率が悪かったです。なので一本鎖同士をくっつけて、それを形質転換しているだけかも

UO @druoh

@timasaki @teatimest そうなると、末端のhomologyが低いと効率が落ちるか変なんができそうですね。

Tea gondii @tea_gondii

@druoh @timasaki もうちょっと補強した版ですが、これで制限酵素サイトが殺せたらなと思ったわけです。 http://yfrog.com/ke5jhp

ima3 @timasaki

@teatimest 正直やってみないと分からないです。とりあえず仕掛けてみて、その間に vector 領域を増やせる primer 発注するというのはどうでしょう？vector PCR で増やせば制限酵素サイトは削れます

Tea gondii @tea_gondii

@druoh @timasaki ベクターをＰＣＲするのですね。その手があったのですね。ありがとうございます。

UO @druoh

@teatimest @timasaki 下図で、切った制限酵素の次を変えれば潰れますよ。例えばgaatt-cのサイトでhomologyをgaattまでにして次をgにすればつながった後はgaatt-gになるという具合。どうでしょう？

ima3 @timasaki

@teatimest pcr あとにDpnI でテンプレート処理するのお忘れなく。私はo/n でやってます @druoh

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki DpnIってなんですか？

UO @druoh

@teatimest dpnIは大腸菌で増えたメチル化Dnaを切ってくれます。PCR産物はメチル化されない。

Tea gondii @tea_gondii

それでテンプレートだけ消化してPCR産物のみにするのですね。うおさん、ありがとう。 RT @druoh: @teatimest dpnIは大腸菌で増えたメチル化Dnaを切ってくれます。PCR産物はメチル化されない。

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki @druoh 実は、もっとややこしい解決方法で手を打っている最中なのです。ベクターをもうちょっと上流と下流で切って、制限酵素配列なしプライマーでその切られた5'&3'の１ｋｂをＰＣＲで増幅、そして、５’＆３’フラグメントと目的の遺伝子のＰＣＲプロダクト、三本を

ima3 @timasaki

@teatimest むつかしいっすw

UO @druoh

@teatimest ピンと来ないw

Tea gondii @tea_gondii

えー、ちょっとまって。お絵かきるから。@timasaki @druoh

Tea gondii @tea_gondii

ごめんなさい、提出おそくなりました。先生、これでどうでしょうか？in-fusionいけるでしょうか？ @druoh @timasaki http://yfrog.com/h05p3lp