制限酵素サイトの跡形がのこらないクローニング

ima3 @timasaki

@teatimest いけるはずw

空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

@teatimest TL遡って覗かせてもらいましたがベクターの制限酵素サイトの一部潰して目的遺伝子をクローニングするなら、typeIISの制限酵素使った方が早い気がするんですけど、何か障害があるんでしょうか。

Tea gondii @tea_gondii

そんな制限酵素あるんですね。勉強不足でした。RT @DYKDDDDK: teatimest TL遡って覗かせてもらいましたがベクターの制限酵素サイトの一部潰して目的遺伝子をクローニングするなら、typeIISの制限酵素使った方が早い気がするんですけど、何か障害があるんでしょうか。

空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

@teatimest その辺のプラスミドいじりが得意なラボにいるので、それなりの知識が付きましたのです。参考までに。http://bit.ly/nmWw3a

Tea gondii @tea_gondii

@DYKDDDDK でもどうやって使えるのか分からないです。ペーパーよんでみます。ありがとうフラグ先生！

空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

@teatimest 分かんなかったら言ってくださいねー。PCRさえできれば、色んな使い方ができますよ。 http://twitpic.com/5x00iu

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空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

@teatimest あ「PCRで作って」→「プライマでIIS site付けてdigestして」と置き換えてください

ε(ﾐﾐ ๑･ิ 』･ิ๑ )💙💛🕊ﾓﾓﾌﾓﾌ💉𖤣𖥧𖥣｡ @edamame0811

@DYKDDDDK @teatimest この論文のFig1(b)で良いんかな? → http://bit.ly/o2euef

空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

@Odamame0811 まさしくー。僕はこれでpoint mutant、deletion、chimera、taggedまで作ります。 @teatimest

ε(ﾐﾐ ๑･ิ 』･ิ๑ )💙💛🕊ﾓﾓﾌﾓﾌ💉𖤣𖥧𖥣｡ @edamame0811

@teatimest ‘Type IIS" FokI and AlwI that cleave their recognition sequence to one side. http://bit.ly/pQPPxZ

ろってぃ @zakuro0603

コンストラクションの方法もどんどん進歩してるんだなあ。Type IISなんて聞いたこともなかった（汗）

ε(ﾐﾐ ๑･ิ 』･ิ๑ )💙💛🕊ﾓﾓﾌﾓﾌ💉𖤣𖥧𖥣｡ @edamame0811

（私の作るﾗｲﾌﾞﾗﾘはtypeIIIのEcoP15Iを使って作ります。cutする場所まで25/27nt）

Kawai, F. @FumihiroKawai

複雑なことなどしてこなかったし。せいぜい長さを変えたり、タグを付けたり、変異入れたり、全合成したり。。。時代は進んでるのだよね。。。

空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

@teatimest http://bit.ly/qRApgj DpnIはこれです。メチル化DNAを４塩基認識で切ってくれるので、プラスミドを細かく切って、PCR産物は残ります。

空飛ぶペプチドタグ @DLYDDDDK

StratageneのQuickchangeよりBsmBIの方が好き。

UO @druoh

@teatimest @dykddddk 寝てたw typeIIつまり認識配列と来れる場所が違うやつだね。そういう名前であるとは知らずに使っていたなぁ。

Tea gondii @tea_gondii

SLICやったんだけど、何も生えてなかった、、、どこが行けなかったんだろう。RT @druoh: @teatimest コントロールに生えていないといいねｗ

Tea gondii @tea_gondii

@druoh @timasaki T4 treatmentの時、1ugに満たなかったので300ngでやったのがまずかったのか、RecA treatmentの時、NEB ligase bufferじゃ無くて、他のブランドのligase buffer (ちゃんとATP入り)使ったから

UO @druoh

@teatimest オレも1回やって生えなかった。ただバッファーがどれ使っていいか不明のがあったからそれかもと思っているけど、別のアプローチでできたからそのあとやってない・・・。

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki @druoh T4 polymeraseが効きすぎたのか、RecAにNEB ligation bufferが必要なのか、、、RecA bufferでやったらATPが無いからrecombinationされないと思うけど、LucigenのLigation buff

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki @druoh LucigenのDNA ligation bufferはATPあるからいけると思ったのですが、NEB Ligation Bufferのみでは売ってないのかな、、、

ima3 @timasaki

@teatimest 原因よく分からないけどおそらくコンピテンシーが低いんでないかな？市販のコンピテントセルくらいのコンピテンシーあったほうが良い。あとtransform 後に SOC での pre-culture 私は 30min-1h やってる

Tea gondii @tea_gondii

@timasaki 市販のone-shot TOP10使ったし、平行でin-fusionやったやつは生えてきたので、competency は大丈夫だったみたい。SOCは1時間振りました。うーん、、、、

ima3 @timasaki

@teatimest 売ってる >NEB Ligation Bufferのみでは売ってないのかな

UO @druoh

@timasaki @teatimest これ？http://t.co/QySfSz3Y