制限酵素サイトの跡形がのこらないクローニング

Tea gondii @tea_gondii

ありがとう、オーダーします。RT @druoh: @timasaki @teatimest これ？http://t.co/hLB6kZMP

ima3 @timasaki

@teatimest あと可能性は dCTP の持ち込みが多すぎて transformation 阻害 or vector + insert の量が少なすぎ。持ち込み多すぎの場合は量を減らす、少なすぎの場合は量を増やすで対処。私は transform 50 ul くらいでやってる

Tea gondii @tea_gondii

なるほど、dCTPが阻害しちゃうのですね、、、プロトコル通り10mMを使ったのでOKなはずなんだけど、、、涙涙。RT @timasaki: @teatimest あと可能性は dCTP の持ち込みが多すぎて transformation 阻害

ima3 @timasaki

@teatimest recA reaction 時に T4 product を薄めて使っているはず。そのときの薄め具合によって持ち込みが決まってくる。プロトコル通りなら濃すぎることはない

Tea gondii @tea_gondii

あ、それかも、、、RT @timasaki: @teatimest recA reaction 時に T4 product を薄めて使っているはず。そのときの薄め具合によって持ち込みが決まってくる。プロトコル通りなら濃すぎることはない

Tea gondii @tea_gondii

元のDNAが薄かったので、T４ reaction　1ulを10ulのRecA reactionに使ったので、RecA reactionの時100uMのdCTPが入っている勘定になるのです。 @timasaki

Tea gondii @tea_gondii

論文にはT4 reactionを3ng分入れてねってあったので、そうとう薄めてRecAにいれますよね。そこが問題だったのですね。RT @timasaki: @teatimest いくつか濃度を変えたのを仕掛けてみるのをお勧めします。論文の濃度にしたのも試してください

ima3 @timasaki

@teatimest いくつか濃度を変えたのを仕掛けてみるのをお勧めします。論文の濃度にしたのも試してください

Tea gondii @tea_gondii

ありがとう、あとtransformation 50ulってRecA reactionを50ulつかうの？5ulつかって50ulのコンピをやりました。RT @timasaki: vector + insert の量が少なすぎ。私は transform 50 ul くらいでやってる

ima3 @timasaki

@teatimest recA product は 5 ul でコンピ 50ul