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@timasaki
[緩募] 皆さん大腸菌で共発現させるとき、発現させる遺伝子の順番はどのように決めているのでしょうか？サイズが大きい物を前に持ってきたほうが良いとか、経験談も合わせて教えていただけると助かります
2011-07-15 01:39:02
ima3
@timasaki
質問が悪かったかも、同じベクターにクローンする際の順番とか、違うプラスミド使って co-transformatin してだとか、そういったのをどうしているのでしょう？
2011-07-15 01:44:54
Naoki Sakai
@nsakaii
@timasaki 僕のそれほど多くない経験ではタンデムはあまり上手く行かないのでベクター２種類使ってます．pETとpRSFとかpETとpCDFとか…
2011-07-15 01:47:35
hide_hdb
@hide_hdb
@timasaki 今、自分がやってるのは違うベクター２種にそれぞれの遺伝子をクローニングしてCotransformしてます。
2011-07-15 01:53:27
ima3
@timasaki
@nsakaii pET duet はやはり大腸菌だと基本なんですね。今度 ACEMBL システムをコラボで使うことになりそうなので設計を悩んでいます www.atg-biosynthetics.com/uploads/ACEMBL/MultiColiBrochure.pdf を
2011-07-15 01:54:54
Naoki Sakai
@nsakaii
@timasaki そうですね．ただ最近聞いたのは共発現時にはT7は強すぎるかも…とか．その方はpTrcにプロモーターを変えて上手く行っていました．酵素サブユニットの共発現でした．
2011-07-15 01:55:11
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@timasaki
@hide_hdb ありがとうございます。もしよければどのベクター、プロモータ、Ori を使ったか教えていただけるとありがたいです。
2011-07-15 01:56:35
Hiroshi Sasaki
@popeetheclown
@timasaki 非常に大きな複数の遺伝子をpETDuetへタンデムに入れる場合，ある順番で遺伝子をベクターへ挿入しないと入らない（ポジティブクローンができない）ということがありました．発現への影響についてではないのですが，一応．
2011-07-15 01:57:05
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@timasaki
@hshigema 我々の場合は Multi-Bac system 一辺倒です。クローニングの際にすべての gene を同じベクターに突っ込んで、それを bacmid に大腸菌使って Tn5 で入れてます。
2011-07-15 01:58:55
Hiroshi Sasaki
@popeetheclown
@nsakaii @timasaki LacO制御は細胞ごとに発現する／しないが決まってしまい，IPTG濃度を薄くしてもすべての大腸菌細胞で発現レベルを落とすということができない（難しい）ので，発現量調節にアラビノース誘導系を利用することもありました．ベクターを作るのが面倒ですが
2011-07-15 01:59:21
Hiroshi Sasaki
@popeetheclown
@FumihiroKawai Duetの方がよい（ということがある），というのは僕も聞いたことがあります（実体験ではない）．あと，oriが同じでも薬剤耐性が違えば，どうにかなったりもしますよね．
2011-07-15 02:01:51
Naoki Sakai
@nsakaii
@popeetheclown @timasaki DH5aやJM109を使っていてもポジティブが取れない時はありますよね…不思議
2011-07-15 02:02:44
Naoki Sakai
@nsakaii
@popeetheclown @FumihiroKawai @timasaki タンデムか異種ベクタかはほんっとにcase by caseですね．とりあえず試すしかない，という感じです．
2011-07-15 02:04:22
Hiroshi Sasaki
@popeetheclown
B4の思い出．ある遺伝子を大腸菌ベクターに入れたところ，全くコロニーが生えないことがあった．原因を探ると，タンパクではなく転写産物自体がtoxicに働いていた（フレームシフトを導入しても結果が変わらない）．LacI欠損であるDH5aを使ってはいけないことに気づくのに1ヶ月．
2011-07-15 02:05:14
Hiroshi Sasaki
@popeetheclown
ちなみにその遺伝子（を含むベクター）はBL21に対してもtoxicに働くため，形質転換すると，グルコースなどを加えてリークを抑制しても菌が死んでしまうというシロモノだった．未だに，どういうメカニズムだったのかわからないのが悔やまれる．
2011-07-15 02:06:44
hide_hdb
@hide_hdb
@timasaki ベクターのベースはpET16bとpRSF-1bでプロモータ両方はT7ですかね。Oriはパッと出てきません。すんません。
2011-07-15 02:07:26
Hiroshi Sasaki
@popeetheclown
@nsakaii @timasaki @FumihiroKawai 結局ありがちな結論ですが，可能な限り試してみるしかないですよね＞大腸菌共発現．一応，異種ベクターの場合はstoichiometryとプラスミドのコピー数の関係を気にしてはいたのですが，自由度がそんなにないですし．
2011-07-15 02:08:31
Naoki Sakai
@nsakaii
@popeetheclown @FumihiroKawai @timasaki stoichiometryとコピー数は気になりますがこれは制御不能だと思ってます．複合体だけを精製してきて誤摩化してます…大腸菌だからそれでもいいかなと（大腸菌の良い点）
2011-07-15 02:11:00